可溶性酸性轉化酶(Soluble acid invertase, S-AI)試劑盒說明書可見分光光度法 貨號:DM-SP10021 規格:50 管/24 樣正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:蔗糖轉化酶(Invertase,Ivr)催化蔗糖不可逆地分解為果糖和葡萄糖,是高等植物蔗糖 代謝關鍵酶之一。根據*適 pH,Ivr 分為酸性轉化酶(AI)和中性轉化酶(NI)兩種類型。AI 的*適 pH 為 3~5。AI 分為可溶性 AI(S-AI)和細胞壁不溶性 AI(B-AI)兩種類型。 S-AI 主要存在于細胞液泡或自由空間中,*適 pH 為 4.5~5.0(酸性),通過降解液泡中蔗 糖,調節液泡中蔗糖的利用和果實內糖類的積累。測定原理:S-AI 催化蔗糖降解產生還原糖,進一步與 3,5-二硝基水楊酸反應,生成棕紅色氨基化合物,在 510nm有特征光吸收,在一定范圍內 510nm 光吸收增加速率與 S-AI 活性成正比。 自備用品:可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。 試劑組成和配制:提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;試劑一:液體 50mL×1 瓶,4℃保存;試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存;臨用前加入25mL試劑一充分溶解備用;用不完的試劑 4℃ 保存;試劑三:液體 30mL×1 瓶,4℃保存;粗酶液提取:按照組織質量( g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL 提取液),進行冰浴勻漿。12000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。測定步驟和加樣表:試劑名稱 (μL)測定管對照管樣本200200試劑一800試劑二800混勻, 37℃準確水浴 30min 后,95℃水浴 10min(蓋緊,以防水分散失),流水冷卻后充分混勻(以保證濃度不變)試劑三500500混勻,95℃水浴 10min(蓋緊,以防止水分散失),流水冷卻后充分混勻,510nm 處,蒸 餾水調零,記錄各管吸光值 A,如果吸光值大于 2,可以用蒸餾水稀釋后測定(計算公式中乘 以相應稀釋倍數),ΔA=A 測定-A 對照。S-AI 活性計算:標準條件下測定的回歸方程為 y = 0.0016x -0.001;x 為標準品濃度 (μg/mL),y 為吸 光值。(1)按蛋白濃度計算:單位的定義:37℃每mg蛋白每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。S-AI 活性 (μg/min/mg prot)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T =20.8×(ΔA +0.001)÷Cpr(2)按鮮重計算:單位的定義:37℃每g組織每分鐘產生1μg還原糖定義為一個酶活性單位。S-AI 活性 (μg/min/g 鮮重)=[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W ×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001)÷WV1:加入反應體系中樣本體積,0.2mL;V2:加入提取液體積,1mL;T:反應時間,30min;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g。